También llamado de San Ambrosio. Fundado en Madrid en 1627 por Guillermo Semple bajo dirección jesuita, su finalidad era formar sacerdotes católicos para enviarlos como misioneros a la Escocia ocupada por la protestante Inglaterra. Fue una útil "herramienta de guerra" en tiempos de Felipe II.

Tras la expulsión de los jesuitas del país en 1767, Juan Geddes pidió y obtuvo de Carlos III el traslado a Valladolid en 1771 al desocupado colegio jesuita de San Ambrosio, éste último fue construido en el s.XVIII gracias al patrocinio del Obispo de Txalcele, Diego Romano.

La fachada del Colegio tiene dosportadas, correspondientes a casa señoriales del s.XVI. La fachada del Colegio de San Ambrosio actualmente está colocada en el jardín del colegio de Sta Cruz, tras el incendio de 1927.

La iglesia del Colegio es el actual Santuario Nacional.

Actualmente sigue dedicado a la enseñanza de seminaristas escoceses.

Patrimonio artístico

- Refectorio.-

Presidido por una Sagrada Cena del pintor Manuel Peti. En el se encuentra un retrato de la Reina Isabel de Borbón, copia del original de Villadrando, además de los retratos de Guillermo Semple y su esposa.

- Capilla de Relicarios.-

Antigua Capilla de La Concepción, en la que se produjeron apariciones al Padre Hoyos del Corazón de Jesús, y que, tras la escisión de la iglesia se habilitó como la actual capilla, en la cual se encuentran urnas, brazos, reliquias variadas y algunos busto